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分光光度計(jì)的常見(jiàn)用途

發(fā)布日期: 2020-11-30
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核酸的定量
核酸的定量是分光光度計(jì)使用頻率高的功能??梢远咳苡诰彌_液的寡核苷酸,單鏈、雙鏈DNA,以及RNA。核酸的高吸收峰的吸收波長(zhǎng)260 nm。每種核酸的分子構(gòu)成不一,因此其換算系數(shù)不同。定量不同類型的核酸,事先要選擇對(duì)應(yīng)的系數(shù)。如:1OD 的吸光值分別相當(dāng)于50μg/ml的dsDNA,37μg/ml的ssDNA,40μg/ml的RNA,30μg/ml的Olig。測(cè)試后的吸光值經(jīng)過(guò)上述系數(shù)的換算,從而得出相應(yīng)的樣品濃度。測(cè)試前,選擇正確的程序,輸入原液和稀釋液的體積,爾后測(cè)試空白液和樣品液。然而,實(shí)驗(yàn)并非一帆風(fēng)順。讀數(shù)不穩(wěn)定可能是實(shí)驗(yàn)者頭痛的問(wèn)題。靈敏度越高的儀器,表現(xiàn)出的吸光值漂移越大。
事實(shí)上,分光光度計(jì)的設(shè)計(jì)原理和工作原理,允許吸光值在一定范圍內(nèi)變化,即儀器有一定的準(zhǔn)確度和精確度。如Eppendorf Biophotometer的準(zhǔn)確度≤1.0%(1A)。這樣多次測(cè)試的結(jié)果在均值1.0%左右之間變動(dòng),都是正常的。另外,還需考慮核酸本身物化性質(zhì)和溶解核酸的緩沖液的pH值,離子濃度等:在測(cè)試時(shí),離子濃度太高,也會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)漂移如TE,可大大穩(wěn)定讀數(shù)。樣品的稀釋濃度同樣是不可忽視的因素:由于樣品中不可避免存在一些細(xì)小的顆粒,尤其是核酸樣品。這些小顆粒的存在干擾測(cè)試效果。為了大程度減少顆粒對(duì)測(cè)試結(jié)果的影響,要求核酸吸光值至少大于0.1A,吸光值好在0.1-1.5A。在此范圍內(nèi)混合液不能存在氣泡,空白液無(wú)懸浮物,否則讀數(shù)漂移劇烈;必須使用相同的比色杯測(cè)試空白液和樣品,否則濃度差異太大;換算系數(shù)和樣品濃度單位選擇一致;不能采用窗口磨損的比色杯;樣品的體積必須達(dá)到比色杯要求的小體積等多個(gè)操作事項(xiàng)。
除了核酸濃度,分光光度計(jì)同時(shí)顯示幾個(gè)非常重要的比值表示樣品的純度,如A260/A280的比值,用于評(píng)估樣品的純度,因?yàn)榈鞍椎奈辗迨?80nm。純凈的樣品,比值大于1.8(DNA)或者2.0(RNA)。如果比值低于1.8 或者2.0,表示存在蛋白質(zhì)或者酚類物質(zhì)的影響。A230表示樣品中存在一些污染物,如碳水化合物,多肽,苯酚等,較純凈的核酸A260/A230的比值大于2.0。A320檢測(cè)溶液的混濁度和其他干擾因子。純樣品,A320一般是0。
蛋白質(zhì)的直接定量(UV法)
這種方法是在280nm波長(zhǎng),直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式,光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度,或者是選擇相應(yīng)的換算方法,將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單,先測(cè)試空白液,然后直接測(cè)試蛋白質(zhì)。由于緩沖液中存在一些雜質(zhì),一般要消除320nm 的“背景”信息,設(shè)定此功能“開(kāi)”。與測(cè)試核酸類似,要求A280的吸光值至少大于0.1A,的線性范圍在1.0-1.5 之間。實(shí)驗(yàn)中選擇Warburg 公式顯示樣品濃度時(shí),發(fā)現(xiàn)讀數(shù)“漂移”。這是一個(gè)正常的現(xiàn)象。事實(shí)上,只要觀察A280的吸光值的變化范圍不超過(guò)1%,表明結(jié)果非常穩(wěn)定。漂移的原因是因?yàn)閃arburg 公式吸光值換算成濃度,乘以一定的系數(shù),只要吸光值有少許改變,濃度就會(huì)被放大,從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法,適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō),速度快,操作簡(jiǎn)單;但是容易受到平行物質(zhì)的干擾,如DNA的干擾;另外敏感度低,要求蛋白的濃度較高。
比色法蛋白質(zhì)定量
蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的混合物,比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分:氨基酸(如酪氨酸,絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng),產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān),從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。
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